胰岛素

糖尿病是一种全球性疾病，有超过 4.2 亿人（世界人口的 6%）患有糖尿病，预计到 2030 年这一数字将激增至 5 亿，到 2045 年将激增至 7 亿。全世界糖尿病患者人数的增加将导致对胰岛素的需求随之增加。此外，对负担得起的胰岛素的需求未得到满足，尤其是在低收入和中等收入国家。许多完全依赖胰岛素生存的 1 型糖尿病患者无法获得胰岛素。对于需要胰岛素治疗的 6000 万 2 型糖尿病患者，其中有二分之一的人由于价格问题而没有获得胰岛素（WHO 2021）。

注射胰岛素对于治疗 1 型和 2 型糖尿病都很重要，重组人胰岛素已被证明比提取的胰岛素具有显著优势。对于胰岛素的生产，报道有两种不同的生产方法。在第一种方法中，胰岛素的 A 链和 B 链作为包涵体分别在细菌中培养。然后，对两条链进行单独纯化，然后进行化学结合，之后进行最终的纯化步骤。在第二种技术中，胰岛素原在大肠杆菌中的表达采用色氨酸启动子的形式，以蛋氨酸与胰岛素原相连。溴化氰 (CNBr) 用于切割连接，然后通过正确的二硫键形成折叠肽，并最终通过酶促作用消除 C 肽。优选采用“胰岛素原路线”，因为它只需要单一的发酵和纯化程序，与双链组合方法相比，生产过程更加高效。

除了使用细菌作为宿主系统外，酵母也被用于胰岛素的商业生产。商业上使用的主要酵母菌株是酿酒酵母和毕赤酵母。基于酵母的表达系统产生分泌到培养物上清液中的可溶性胰岛素前体。使用细菌和酵母作为表达系统各有利弊。通过细菌包涵体途径生产前体胰岛素通常会产生更高的产物浓度和生产率。与生物活性治疗性蛋白的可溶性表达相比，包涵体具有良好的机械稳定性并且能够抵抗蛋白水解降解。在下游纯化方面，与需要从培养上清液中去除大量宿主细胞蛋白杂质的分泌蛋白相比，包涵体中的目标蛋白也以更纯和更浓缩的状态分离。与宿主蛋白相比，由于包涵体的大小和密度不同，因此从包涵体中分离肽也更容易。

使用大肠杆菌作为大规模重组胰岛素生产的表达系统具有生长速度高、培养基要求简单、易于操作、产量高和成本效益高的优点。大肠杆菌也有很好的遗传学特征，并且有大量的突变宿主菌株和克隆载体可供使用。然而，大肠杆菌的包涵体生产途径需要复杂的处理，例如溶解和重折叠程序，以获得功能齐全的多肽。对于大多数生物制药公司而言，大肠杆菌仍然是生产重组胰岛素的首选宿主系统，在大多数情况下，人胰岛素及其类似物在包涵体中表达。胰岛素类似物是合成产生的胰岛素变体，其氨基酸序列与天然人胰岛素不同。已经进行了此类改变以更接近地模拟人体中胰岛素分泌的正常生理模式。

处在大肠杆菌包涵体中的单链胰岛素前体分子大多被错误折叠。从细胞中提取包涵体，洗涤，然后溶解前体分子。胰岛素原的产生需要肽折叠和二硫键的伴随形成。酶促反应后，再折叠的前体分子通过去除 C 链和 N 端融合肽而转化为异二聚体胰岛素分子。需要各种层析纯化步骤来去除宿主细胞蛋白质、核酸、细胞膜碎片和消化副产物，以产生高度纯化的产品。

从大肠杆菌包涵体中纯化重组人胰岛素/类似物的下游工艺很复杂，涉及多个步骤，不同公司建立的工艺流程的细节通常是其专有的。每一步采用的方法都会对下一步的产品纯度和收率产生重大影响，因此在开发和优化方面做深入的考量和研究。