双特异性抗体（bsAb）

双特异性抗体（bsAb）可以同时结合两种不同类型的抗原或同一抗原上的两种不同表位，其可以按多种结构形式制备，大体可分为 IgG 样和非 IgG 样两大类，前者保留了传统mAb两个 Fab 臂和一个 Fc 区的结构，但两个 Fab 位点结合不同的抗原，其通常用 quadroma， 或杂合杂交瘤，方法制造，但这种方法依赖随机机会形成可用的 bsAb，效率低下。另一种制备 IgG 样 bsAb 的方法称为“knobs into hole”（KiH），它依赖于从一个 mAb 中引入重链中大氨基酸的突变，以及另一个 mAb 重链中小氨基酸的突变。这使得目标重链（及其相应的轻链）能够更好地结合在一起，并使 BsAb 的生产更加可靠。非IgG样bsAb 完全缺乏 Fc 区，因此设计策略相对简单。这包括化学连接的 Fab，以及各种类型的二价和三价单链可变片段 (ScFv)，此外，还有一些可以模拟两种抗体可变结构域的融合蛋白。其中，新的形式还包括双特异性 T 细胞衔接器器 (BiTE)、四价反平行结构 (TandAbs) 以及仅VH 的Bi-Nanobody。多种非 IgG 样 bsAb的共同特点是分子量低，因此肿瘤组织通透性高，但半衰期相对较短。

通过不同的结构设计和作用机制，相比传统抗体，bsAb的治疗性优势包括：介导免疫细胞对肿瘤细胞发挥杀伤作用；双重靶向免疫检查点，发挥独特或重叠功能，有效防止耐药性；增强的特异性、靶向性和降低的脱靶毒性；有效降低治疗成本，如研究显示BiTE的治疗效果可达常规抗体的100-1,000倍，剂量可低至原剂量的1/2000，从而显著降低药物治疗成本。与联合疗法相比，bsAb的成本也远低于两种单药组合的成本。

大肠杆菌是表达scFv的常见选择，因为细菌可在廉价培养基上生长迅速，并且可以大量生产蛋白质。然而，表达的 scFv 分子可能会被错误折叠或形成包涵体，需要额外的下游工艺步骤来溶解和重折叠蛋白质。使用哺乳动物细胞系，如CHO，可以克服这些问题，因为真核细胞具有先进的内部蛋白质折叠过程以及进行复杂翻译后修饰的能力，其可稳定地表达蛋白质并达到足够高的滴度，且具有良好的生产可放大性。基于类似的原因，IgG样bsAb主要在哺乳动物细胞系中表达。但对于不对称异源二聚体结构，需要特定的蛋白质/细胞工程，如已报道的KiH和CrossMab技术，以促进正确的配对，缓解游离的重链、轻链、同源二聚体、半分子和错配的抗体等杂质带来的挑战，提高产品的可制造性。

细胞培养基的成分已被证明会影响产品质量，因此应考虑将培养基设计作为控制细胞培养收获液中部分产品、聚体和产品异构体水平的一种手段。同时，细胞培养温度的调节也被证明可控制半抗体和聚体的形成。在培养方式方面，研究显示，相比传统补料分批培养，灌流培养可通过降低产品在生物反应器内的滞留时间，防止积聚以及浓度增加，降低bsAb分子的物理或化学降解，而提高bsAb的质量和产量。

在下游工艺中，由于mAb和bsAb之间存在一定的结构相似性，目前许多bsAb的纯化方法都是基于常规 mAb 的成熟纯化工艺来开发的，如通常使用亲和、电荷、尺寸、疏水和混合层析模式，并应用其它策略来克服 bsAb 带来的独特挑战，包括聚体、片段形成和错误配对的产品。Protein A亲和层析仍是bsAb下游工艺中最常用的亲和纯化方法之一。此外，在bsAb设计中，通过在一条重链引入点突变，改变Protein A结合亲和性，即可通过差异Protein A亲和层析，区别同源和异源二聚体，实现有效的分离和杂质去除。Protein A亲和层析也被证明可有效通过pH梯度洗脱从目标产物中分离半抗体。同样的策略，也被探索用于Protein G。而对于基于片段的bsAb，可选择固定化金属亲和层析（IMAC）或能够与CH1区域或Kappa或Lambda 链结合的亲和配基，如Protein L亲和层析。离子交换层析通常作为精纯步骤，结合特定的操作条件，其也可用于去除错配产物和片段。通过组合和利用多种基本分离技术的混合模式层析显示出了进一步提高下游纯化平台能力的潜力，不同类型的此类填料已被证明可用于去除错配的产物、片段以及聚体。切向流过滤常用于工艺流程中的浓缩和换液目的，但也有研究显示，通过选择特定的孔径，如300kD，可以很好地去除bsAb聚体。