质粒是存在于古生菌、细菌以及部分酵母中的含有染色体外遗传信息的小型双链环状 DNA 分子，其包含至少一个复制起点，可独立自主复制，一个细胞可以包含单个质粒的多个拷贝。质粒骨架序列的遗传信息可能不是必需的，但至少有助于细胞在其给定环境中生存。
在过去的几十年中，质粒DNA（pDNA）成为了遗传学和分子生物学以及最近的基因治疗和核酸疫苗中最重要的工具之一。在制药应用中，质粒的使用包括直接和间接两种方式，如质粒直接给药给患者，即患者体内将含有DNA本身，对于此类应用，如DNA疫苗，完整良好的生产规范（GMP）是绝对必要的，因为DNA本身就是活性药物成分(API)。另一种方式是间接方式，即pDNA不直接用于患者给药，而用于生产转染细胞的病毒载体或治疗性蛋白质，或用作模板以生产mRNA，即其不是API，而作为API生产的原材料或起始物料，但即使在这种情况下，质粒产品也需按照特定监管要求（在质量控制和过程记录方面），符合适用的标准。
科研实验室的质粒制备常使用市售提取试剂盒，但这种方式不适用于需要数毫克或数克规模的工业化质粒生产，而且更重要的是，实验室方法制备的质粒在纯度和安全性等质量方面的可重现性较低，而这对于制药应用是一个先决条件。鉴于pDNA在当前先进疗法开发中的广泛应用，其已成为下一代生物制药应用中的关键物料，行业对高质量pDNA的需求也在不断增加，所以，其生产必需实现更高的效率和生产力。
宿主细胞的选择
宿主细胞的选择是生物药生物工艺的决定性因素之一，而质粒的产生是菌株/质粒依赖性的，因此为特定目的质粒选择合适的菌株至关重要，合适的宿主菌株的特性包括被质粒转化的能力以及其培养至高生物量的可行性。由于大肠杆菌（E.Coli）有大量可用的生物信息以及在pDNA 生产中的用途，根据实验室用途和商业可用性，已经有多种菌株被选择用于生产pDNA。
此外，由于将pDNA引入E.Coli会导致代谢负担，通常反映为生长速率和生物量的降低，以及乙酸产量的增加。在整体生理水平上了解质粒生产的影响机制是一项不小的挑战，但这些知识可以为进一步的细胞工程提供有用的信息，如已有研究通过基因敲除或基因过表达，来减轻宿主生物的代谢负担或指导宿主机制进行pDNA的复制，从而提高pDNA产量。然而，对宿主细胞的工程处理也可能导致过度修饰，从而难以控制和预测宿主中发生的生理活动。控制宿主细胞的能力在大规模生物工艺操作中非常重要。
对于GMP生产，需建立主细胞库（MCB）和工作细胞库（WCB），以确保可重复的细菌生物的大规模培养，细胞库需经过全面的表征，满足充分的质量标准，包括宿主一致性、质量产量一致性、细胞库的纯度以及容器的检测等，并适当储存，以用于后续生产。
培养工艺和发酵策略
用于重组蛋白生产的成熟培养技术也可同样适用于生产pDNA。然而，由于各种治疗用途需要大量的质粒，因此需要提高pDNA的生产效率。已有多种方法已被提出用来提高pDNA的生产能力，包括单位体积pDNA产量以及细菌细胞特异性生产力。
多个参数会影响细菌生产力，如主细胞库选择、生长速率、培养基、补料速率以及适当的生长条件和参数，如 pH、渗透压和温度。
目前优化的E.Coli发酵通常可达到40 - 60g/L生物量，pDNA产量可达到0.5 - 1 g/L，结合宿主细胞和载体工程，并进一步优化发酵策略，可能可达到> 2 g/L。
发酵规模放大需保持最佳且均质的反应条件，以最大限度地减少E.Coli应激条件暴露并提高代谢准确性，从而提高产量并确保一致的产物质量。需要通过全面且详细的工艺表征，鉴定影响产物产量和质量的最相关的过程参数，并将其作为规模放大参数而尽可能保持恒定，从而制定合适的策略。工艺表征可通过在线或近线检测收集的实时或近实时数据，并结合支持性方法和工具来进行，例如化学计量学数据分析和建模，以及通过计算机流体动力学和规模缩小模型阐明混合和液流条件。为了确保直接且成功的规模放大，发酵设施需严格按照放大标准设计，以降低不同培养罐中工艺条件的差异性，同时充分考虑发酵参数之间高度复杂的相互依赖和相互作用。
细胞收获和裂解
离心是最为常见的E.Coli发酵液收获方式，在实验室规模条件下，其可实现简单、快速的料液处理，对于生产规模，可选择大型碟片式离心机或连续流离心机，其挑战在于较高的固定资产成本投入、较高的能耗以及可能涉及较为繁琐且需开放式处理的手动操作步骤。切向流过滤技术是另一种可简单规模放大且可实现连续封闭式操作的策略，在此过程中，也可将培养基置换至后续裂解步骤所需的缓冲液体系。
在重组蛋白生产中使用的机械裂解方法可用于核酸的分离。但是，蛋白质工艺中使用的高剪切条件可能会导致核酸降解。所以，这里最常用的细胞裂解方法是碱裂解，通常使用~pH 12、0.1 - 0.5 N NaOH溶液进行，结合使用0.1-0.2% SDS或Triton X 1-00，通过利用细胞膜的脆弱性来破坏细胞，并保持完整的 pDNA。这种方法的规模放大会有一定的挑战，因为粘度增加可能会在混合过程中导致对pDNA的剪切。此外，在大规模条件下可能存在pH梯度，需保证充分但不过于强烈的混合。而裂解过程的时间也可直接影响pDNA的质量和数量，如时间过长，可能导致pDNA不可逆地变性。所以，良好设计的混合设备和仔细控制的裂解参数是成功的关键。
澄清
细胞裂解后，将需要除去固体。由于裂解液的粘性，这将是一个非常关键的步骤。可使用离心或特定孔径规格的深层过滤器去除杂质。最近，絮凝被报导用于过滤操作的预处理步骤。还有一些策略通过使用高盐缓冲液和离液剂进行沉淀来去除污染物。通常，澄清后的细菌细胞碱裂解液中，仅约3%的内容物为pDNA，而剩余的97%为其它杂质，包括蛋白质65%、RNA 25%、内毒素4%以及基因组DNA 3%，这种复杂性也是pDNA下游工艺的挑战所在，其它挑战还包括其本身较大的粒径、高粘度、剪切敏感性以及与杂质的相似性。
切向流过滤
切向流过滤是一种可简单规模放大且经济高效的pDNA浓缩以及缓冲液置换技术，并可通过合适膜MWCO的选择，部分去除线性DNA、RNA以及内毒素等杂质，截留pDNA。切向流过滤操作的一个挑战是该步骤过程中料液不断增加的粘度以及pDNA的剪切敏感性。且在某些情况下，由于pDNA的结构特性或由于更高的离子强度所导致的有效粒径的较低，pDNA可能会穿过比其粒径更小的膜孔而导致损失。因此，鉴于3-5X的膜孔选择经验法则，为保证收率，可选择该范围的低值。
层析
最终的pDNA必需符合预先确定的质量要求，如无宿主细胞蛋白质、基因组DNA、RNA以及内毒素，且针对特定应用，可能要求超螺旋pDNA百分比>90%，所以，pDNA工艺流程中包含层析步骤被认为是生产高效且安全的pDNA的基本要求。鉴于杂质的复杂性及其与目标pDNA的相似性，可选择不同模式层析策略的组合[3]。
阴离子交换层析（AEX）利用带负电荷的质粒和带正电荷的固定相之间的静电相互作用，能够从开环 pDNA和裂解液的其它成分中选择性分离超螺旋 pDNA，但电荷和结构与pDNA相似的生物分子，如gDNA、内毒素和一些RNA会共纯化，且pDNA的结合载量低。常与AEX组合使用的策略是疏水作用层析（HIC），其利用单链核酸杂质 (RNA、变性gDNA和变性pDNA)和内毒素的疏水性，促进结合，并通过疏水性支撑物阻碍这些杂质的流动，其可从内毒素和单链核酸中分离pDNA，但需要在高盐浓度下进行洗脱。亲和层析（AC）可在单个纯化步骤中获得高纯度的超螺旋pDNA，并可确保产品在监管机构的标准之内，其利用基于分子识别的自然生物过程，选择性纯化超螺旋 pDNA，但其使用的生物性配基可能不稳定，且通常结合载量较低。另一种可良好去除RNA和蛋白质的方法是尺寸排阻层析（SEC），其利用了pDNA与其它杂质之间不同的流体动力学粒径，但较难去除gDNA。
除菌过滤
除菌过滤旨在截留细菌，确保无菌性。pDNA较大的粒径、纯化后的纯度以及缓冲液的组成，可能影响过滤器的处理量，导致较低的流速，并降低步骤收率。选择合适规格的过滤器前，需综合考虑这些因素，以实现除菌级过滤性能的最大化。
储存
用于制药应用中直接或间接用途的pDNA 产品需要适当的储存系统，其需可监测和报告储存条件，以符合完整的GMP要求。需进行特定的评估研究，以确定最佳储存条件。对于在-20°C 受控条件下储存的pDNA，分析表明，开环和超螺旋或共价闭合环状形式的比例保持不变，没有pDNA的线性化或降解，DNA 的转染显示表达性能不变，即该储存条件有效地保持了 DNA 的完整性[5]。
一般质量要求
鉴于pDNA的不同用途，如在药物开发中是用作原材料/关键起始物料、中间体、药物底物还是药物产品，监管机构和/或pDNA采购方会有不同的质量标准和预期，但包括DNA浓度、生物负荷/无菌性、内毒素（如<0.1 EU/ug 质粒或<5 EU/kg体重）、纯度 – 残留宿主细胞蛋白质(如不可检测或<0.01μg/剂)、基因组DNA（如<0.05μg/ug 质粒或<0.01μg/剂）、RNA（如不可检测） – 和一致性等放行检测是普遍要求[6]。
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