慢病毒

慢病毒是逆转录病毒的一种，粒径为80-120nm，由单链RNA序列组成，其转录成DNA并可整合到宿主基因组中，导致持续感染。大多数慢病毒载体源于HIV-1，并保留整合至感染细胞基因组的能力。LV由于能够更有效地转导非增殖或缓慢增殖的细胞，在临床应用中非常流行。近来，多个使用临床试验使用第三代自灭活LV将基因导入造血干细胞，以治疗原发性免疫缺陷或血红蛋白病[2]。LV最常见的应用是通过嵌合抗原受体（CAR）或克隆的T细胞受体递送引入基因，以产生对抗肿瘤的免疫。

对于慢病毒的上游生产，尽管已经有研究证明制备稳定的慢病毒载体包装/生产细胞系是可行的，其有潜力提高批次间的一致性，保证供应并降低成本[6]，因其可简化LV生产的操作和供应链，但往往需要较长的细胞系开发构建时间，所以基于HEK293T细胞以质粒DNA瞬时转染的策略仍是慢病毒载体大规模生产的主要选择。对于细胞培养，在开发阶段，鉴于仅需要较小的批次体积，以及HEK293T细胞的贴壁特性和耗材的简单可获得性，以贴壁培养为主导。但随着规模放大，需要更高且更一致的批次规模，生产需转移至在摇摆式生物反应器或搅拌罐生物反应器中进行的悬浮培养，而培养基和添加物的选择直接与生产细胞的扩增和活性以及下游工艺的成功有关，因培养基可影响载体的稳定性并组成进入下游的进样料液，需仔细优化。

相比AV或AAV，LV下游工艺的更大挑战在于其为囊膜病毒，固有的复杂性和敏感性需要快速的工艺处理，比如其对冻融循环、盐、pH、剪切以及缓冲液渗透压更为敏感，且颗粒热稳定性较低，37℃下半衰期为7-8 hr[7]。LV的下游工艺也可分为3个主要阶段，包括收获和澄清；中间体纯化，其中包括1个或多个浓缩和纯化步骤；精纯、制剂以及选择性进行的除菌过滤。

LV是细胞外产物，由生产细胞释放到培养液中，所以，收获液质量高度取决于细胞活性，其决定了宿主细胞源性杂质的含量。澄清旨在去除细胞和细胞碎片，深层过滤是该步骤一个简单且经济的选择，经优化后，可达到接近100%的收率。为提高最终产品的整体生物安全性，并符合法规标准，通常需要核酸酶处理，以消解核酸，这也有利于降低料液粘度，方便后续步骤操作，其通常在澄清步骤后进行，但也有报导在更为后续的阶段体积进一步降低后进行。

层析是纯化方案的关键技术，旨在去除蛋白质、核酸、低分子量杂质以及脂质等，以结合-洗脱模式操作的阴离子交换层析和以流穿模式操作的复合模式层析已被报道单独或结合用于LV的纯化，但如前所述，由于LV对盐和pH等条件敏感，需仔细优化层析缓冲液条件。此外也有报道使用固定金属亲和层析和体积排阻层析，但通常限于较小的规模。TFF是快速且稳健的料液浓缩和换液技术，对于LV，可选择MWCO 750kD的中空纤维过滤器。药物底物灌装前的除菌过滤可使用0.22μm过滤器，但考虑LV较大的粒径，报道该步骤损失可达到30-50%，一种降低损失的策略是在最终TFF步骤之前进行除菌过滤，或者使用封闭系统实现无菌工艺而跳过该步骤。