细胞培养技术广泛应用于生物医学研究、再生医学和生物技术生产，但生物和化学因素都可能导致细胞培养物污染。在大多数情况下，细胞生长缓慢、形态改变、培养基pH 值快速变化以及培养物中死亡或漂浮细胞数量增加都是污染的后果。因此，应定期筛查细胞培养中的相应污染物，以防止结果不一致和其它严重后果。同时，需要特殊的防护措施，如生物安全柜、封闭容器和其它专门的防护设备，以最大限度地降低接触危险物质的风险并保证无菌操作条件。本文将简要介绍细胞培养中常见的污染来源，以及相应的预防和缓解措施。
支原体污染
支原体是属于细菌纲柔膜菌的最小的自我复制生物。它们由脂蛋白质膜、核糖体和基因组组成，基因组由580 至 2200 kb 大小的环状双链 DNA 分子组成。支原体的生物合成能力有限，需要进入适当的宿主体内繁殖并存活很长时间。它们的尺寸非常小（~0.1–0.2 µm），无法在标准明视野显微镜下识别，这也是为什么它们经常在许多实验室中无法被发现的原因。它们没有细胞壁，对细胞培养中使用的许多常见抗生素（如青霉素或链霉素）具有抗药性。最重要的是，支原体污染不会产生其它细菌或真菌污染特有的浑浊度。
支原体传播到细胞培养中的典型方式包括从研究实验室或商业供应商获得的受感染培养物、培养基、血清或试剂中引入支原体交叉污染。此外，使用非无菌用品、携带支原体的实验室人员感染、培养箱或通风柜中支原体的扩散、液氮罐中细胞培养物的污染、通过空气中的颗粒物和气溶胶传播、过度使用抗生素以及培养容器密封不当也是导致支原体污染的原因。
尽管支原体与宿主细胞竞争生物合成前体和营养物质，但在受影响的细胞培养物中观察到的生长率变化通常很小，这就是不易检测到相应污染的原因。尽管如此，支原体可以广泛影响宿主的DNA、RNA 和蛋白质代谢，影响细胞内氨基酸和可用 ATP 水平，改变细胞表面抗原，并可引起 DNA 碎片化和显著的染色体改变。因此，定期检测和快速识别此类污染物至关重要。为了实现这一点，开发了许多灵敏且特异的检测，可以检测相应的感染。检测支原体污染的黄金标准是，首先将条件培养上清液样品添加到用于支原体培养的液体培养基中，并在肉汤、琼脂或指示细胞中孵育几天。但这种方法很耗时，因此引入了更快的检测方法。这些方法包括使用荧光染料（如DAPI）进行特异性 DNA 染色、ELISA 检测、用支原体特异性核糖体探针进行 RNA 标记、酶促程序、流式细胞术、比色或基于试纸的支原体检测试验、以及复杂的傅里叶变换红外 (FITR) 显微光谱法。荧光染料染色相当不具特异性，而大多数检测方法具有较高的分析灵敏度（即检测识别污染物的能力）和特异性（即测量支原体而不是密切相关的非支原体物种的能力）。
支原体在受感染的培养物中可以产生多种影响。因此，开发了多种用于清除相应污染物的试剂和方法。目前有多种物理、化学、免疫和化学治疗方法可用于清除支原体污染物。然而，许多这些方法并不实用，因为它们要么非常耗时，需要特殊设备，只能捕获有限数量的支原体物种，要么总体效率低下。起初，引入了几种抑制支原体生长的抗生素，但大多数抗生素效果不佳，且对真核细胞有害，或者由于对相应药剂产生了耐药性而疗效有限。尽管如此，现在有几种更具选择性和有效性的抗支原体试剂，在大多数情况下，只需一轮出轮即可清除支原体感染。在大多数情况下，这些清除剂含有大环内酯类、四环素类、喹诺酮类或它们的组合。它们通过破坏细菌拓扑异构酶 II 来阻断细菌核酸合成，抑制拓扑异构酶 IV 和 DNA 旋转酶的催化活性，以及破坏细菌染色体，从而发挥抑制活性。尽管如此，用这些产品处理或预防支原体感染可能会引起严重的细胞毒性和遗传毒性作用。因此，使用用于清除支原体感染的化合物时应谨慎使用并经过深思熟虑，因为它们有可能改变培养的结果。
病毒污染
与支原体感染相比，细胞培养中的病毒污染物威胁更为严重，因为病毒污染物检测难度大，而且缺乏处理感染的细胞培养物的方法。此外，一些病毒能够将其基因组整合到宿主细胞中，在某些情况下会导致新病毒颗粒的永久产生。这对操作人员来说是一种潜在的健康风险，可能是病毒水平传播到其它细胞系的来源。因此，这对受感染细胞系的生物安全分类有直接影响。不幸的是，用于系统评估病毒污染物的通用检测相当复杂且没有方向。如果无法准确了解病毒的真实性，那检测方法将仅限于电子显微镜和逆转录病毒逆转录酶测定。当怀疑存在传染性病毒时，电子显微镜的多功能性是一种有效、通用且无偏见的手段。该技术适用于获取高分辨率图像，从而立即整体性观察实际的细胞感染状态和病毒的形状。通过观察到的形态和大小，可以立即对病毒类型进行初步分类。例如，成熟的逆转录病毒通常是球形的有囊膜颗粒，平均直径在100 到 200 nm之间，6种逆转录病毒属之间的形态各异。透射电子显微镜 (TEM) 特别适合于直接观察生物样本中的病毒，而无需事先假设传染源。
化学污染
任何在细胞培养中引起不良影响的非生命化合物都需要特别注意。当浓度足够高时，即使是必需的营养素也会产生毒性作用。培养基、血清和水可以将杂质带入细胞培养中。然而，塑料管、细胞培养容器和储存瓶中的增塑剂，以及荧光或紫外线在培养基中形成的自由基或玻璃器皿和移液器上的沉积物，都可能导致污染。最关键的是内毒素，它来自大多数革兰氏阴性菌的外细胞膜。它们由相当稳定的脂多糖(LPS) 组成，这些脂多糖从细菌中脱落，在细菌裂解过程中会大量释放。因此，从玻璃器皿去除热原需要在高温下进行加热，而这些物质对高压灭菌具有相当的耐受性。因此，大多数市售的即用型细胞培养基和添加物都是以不含内毒素或低内毒素水平制备的。此外，可靠的细胞培养基和添加物生产商会提供分析证书，表明相应溶液或化合物中的内毒素水平。
某些培养条件（如低血清浓度、高光照）会刺激高反应性自由基的形成，从而可能导致DNA 损伤、蛋白质交联、脂质氢过氧化物和诱导细胞凋亡。因此，通常在细胞培养基中添加抗氧化剂，如抗坏血酸、N-乙酰-L-半胱氨酸或具有自由基清除活性的维生素，如维生素 E、维生素 A、维生素 C，以防止氧化应激及其后果。或者，可以在培养基中添加微量元素硒，作为抗氧化酶的辅助因子，如谷胱甘肽过氧化物酶，以消灭反应性过氧化物。
此外，高浓度的重金属，如铅、镉和汞，对许多细胞类型都有毒性。因此，在使用前对用于制备培养基或添加物的水和溶剂进行重金属检测非常重要。或者，如果实验室用水不适合细胞培养，则应使用提供分析证书的商业供应商提供的纯化水。
种间/种内交叉污染
细胞系被来自同一物种的无关细胞（种内污染）或来自不同物种的细胞（种间污染）污染是一个常见且反复出现的问题。具体来说，当污染物是快速分裂的细胞系时，它会过度生长并取代原始培养物。如果污染未被发现，可能会导致不可靠和不可重复的结果。交叉污染的来源多种多样，包括通过气溶胶或移液器进行的传播、不同细胞系之间共享培养基和试剂以及培养基使用不当。
有多种方法可用于确定细胞系交叉污染。物种间交叉污染可通过同工酶分析检测，该分析利用电泳结合模式来检查不同物种间一组细胞内酶的单个同工酶的结构和移动性的细微差异。人类细胞的物种内交叉污染可通过对人类淋巴细胞抗原(HLA) 基因座进行分型来识别。此外，分子血清学方法、使用合成探针或引物的基因检测以及基于序列的直接 DNA 测序分型可以区分不同的 HLA 基因型。
清洁和灭菌
生物安全取决于实验室的清洁度。一般准则是严格遵守所有可能的安全规则。忽视或不遵守任何安全规定都可能导致相关感染和环境污染。因此，需要通过对操作期间使用的生物制剂进行净化来降低生物风险。
在适当的废物管理中，应尽可能对灭活方法进行适当的验证。原则上，净化方法主要有四类，即(i) 热灭菌、(ii) 液体消毒、(iii) 蒸汽和气体消毒，以及 (iv) 紫外线照射。高压灭菌是物料灭菌和生物制剂净化或灭活最有效、最可靠的方法。这是一种使用高压水蒸汽的灭菌方法，是培养基、玻璃器皿和移液器吸头净化的首选方法。然而，必须保持足够高的温度和高压一段时间，以保证孢子灭活。通常，在 121°C 下高压灭菌 60-90 分钟足以使废物温度至少达到 115°C 并持续 20 分钟。此外，高压灭菌器的操作和维护只能由经过培训的人员进行，并且应通过生物指示剂定期检查高压灭菌是否成功。必须将废物或高压灭菌物料放置在具有良好热渗透性的容器或密封高压灭菌袋中。危险化学物质或放射性废物不应进行高压灭菌。
化学消毒通常是表面去污的首选方法。为了使消毒剂发挥最佳效果，必须考虑几个因素。首先，消毒剂应具有针对要去除的生物制剂的特异性。其次，消毒剂应适合应用领域，因为当应用于表面或液体时，活性可能会有显著差异。最后，消毒剂的一般应用条件（例如，所需接触时间、工作浓度）以及在存在影响因素（例如，酸、有机负荷）的情况下的有效性可能会有所不同。
在封闭系统中使用类似的蒸气和气体可以提供极好的消毒效果。一些环境使用过氧化氢、二氧化氯、戊二醛、多聚甲醛、环氧乙烷和过乙酸的气溶胶来净化生物安全柜或培养箱。然而，所有这些化学物质都是危险的，使用这些物质消毒只能由有经验和受过培训的人员进行。
最后，暴露于紫外线(UV) 辐照可以有效杀死大多数微生物。尤其是被大气吸收的 UV-C 光（光谱范围：100–280 nm），对各种微生物的破坏力最大。因此，这种紫外线区域通常用于生物安全柜中以减少表面污染。然而，暴露于紫外线可能会导致操作人员的眼睛和皮肤灼伤，因此应谨慎使用。
细胞操作中的生物安全问题
细胞培养可能会对人类健康和环境造成危害，因此需要将其划分为一个考虑多种因素的生物安全水平。在使用某个细胞系之前，必须准确了解这些风险，同时考虑到其固有属性、基因操作类型以及相应细胞系固有的生物危害，而这些危害可能会因污染病原体而显著增加。尽管这些估算必须根据具体情况进行，但也有一些一般准则需要遵循。首先，所研究细胞的遗传关系与人类越接近，对人类的风险就越高，因为污染病原体通常具有特定的物种屏障。尽管如此，仍应小心谨慎，因为某些污染生物有可能跨越通常的物种屏障。其次，细胞系的致瘤潜力在很大程度上取决于其来源。例如，上皮细胞和成纤维细胞具有较低的肿瘤诱导潜力，而造血细胞的肿瘤诱导潜力则明显较高。第三，已在许多实验室中使用多年的、充分表征的细胞系的总体风险低于未经表征的连续生长细胞系或原代细胞。在识别和评估潜在风险后，必须确定避免或降低这些风险的方法，包括隔离、限制人员和设备进出细胞培养实验室、按照标准操作程序(SOP) 工作、避免在工作过程中形成气溶胶或溅出、定期进行细胞培养培训，以及实施和遵守GMP的一般准则。
总结
细胞培养在生物医学和生物制药技术中发挥着重要作用。然而，物种内和物种间交叉污染以及细菌、真菌、或病毒感染可能导致严重后果。因此，每个从事细胞培养的环境都应强制定期进行污染检测和细胞鉴定测试。此外，实施良好的细胞培养规范和无菌技术对于提高细胞培养安全性、促进可重复数据的生成以及可比性至关重要。此外，适当的员工培训以及细胞培养程序文档和报告的标准化是促进细胞培养高质量工作和安全性的进一步有效手段。最后，操作人员的培训与设计良好、工程精良的细胞培养设施建设同等重要。
多宁生物Media C系列培养基是无动物来源成分，无蛋白成分，化学限定的基础培养基，适合采用CHO细胞进行治疗性蛋白产品研发和生产过程中的分批培养，补料分批培养和灌流培养。适合采用搭配DN feed系列搭配使用。该系列培养基均不含L-谷氨酰胺。推荐的L-谷氨酰胺浓度为 4 mM 至 6 mM。
产品特点：
案例研究：
案例一：Media C-01+DN feed 3/DN feed 4组合
推荐细胞：CHOK1(ATCC)
案例二：Media C-03+DN feed 3/DN feed 4组合
推荐细胞：CHOZN
案例三：Media C-04+DN feed 3/DN feed 4组合
推荐细胞：CHOK1(ECACC)
案例四：Media C-05+DN feed 3/DN feed 4组合
推荐细胞：CHOK1(ATCC)
案例五：Media C-06+DN feed 3/DN feed 4组合
推荐细胞：CHOK1SV
*详细产品信息，请联系marketing@duoningbio.com
A.C.Davis, G.Theodosopoulos, I.Atkin, et al., Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines. International Journal of Cancer, 2010.
P.W.Barone, M.E.Wiebe, J.C.Leung, et al., Viral contamination in biologic manufacture and implications for emerging therapies. Nature Biotechnology, 2020.
S.Weiskirchen,S.K.Schröder,E.M.Buhl, et al., A Beginner’s Guide to Cell Culture: Practical Advice for Preventing Needless Problems. Cells, 2023.
S.P.Langdon, Cell Culture Contamination. Cancer Cell Culture, 2004.
留言框-
