细胞培养工艺过程中的产物质量考虑因素

细胞培养工艺中的产物质量判断主要根据其提供目标生物活性的能力，同时最大限度地减少造成任何生物危害的风险。在大多数情况下，以生物学分析甚至动物实验的形式直接检测生物活性并不容易，相反，会检查一些易于测量的物理特征和化学结构特征来评估产物质量。

产物的质量不是一成不变的，有可能随着时间而改变。这种质量的可变性可能在细胞培养过程的不同阶段通过产物合成而变化。它也可能发生在产物收获过程中，甚至在蛋白质被纯化并储存在制剂溶液中之后。根据化学或物理变化的性质，产物质量变化可能以快速或缓慢的动力学方式发生。因此，质量不仅应在药物底物和制剂后的产品上进行衡量。对于在缓慢动力学中变化的变量，质量也在储存条件下进行评估。例如，经过纯化和制剂的蛋白质长时间储存后，可能会出现颜色，或者溶液可能因聚集而变得混浊。这种质量变化只能随着时间的推移进行评估。

一般来说，产品必须不含某些已知的污染物，或能够将其控制在一定水平以下。例如，以啮齿动物细胞生产的蛋白质治疗产品即使经过纯化也可能携带一些宿主细胞成分。在产物纯化过程中未被去除的宿主蛋白质、DNA污染物和最终产品中存在的内源性病毒必须保持在可接受的水平以下，以尽量减少这些污染物对患者造成的风险。

蛋白质的结构异构体经常出现在由细胞培养生产的蛋白质中，比如蛋白质分子序列中的氨基酸与编码序列对应的氨基酸不同。即使没有已知的结构异构体的不利影响，异构体也必须保持在被认为是低风险的某一水平以下。

蛋白质的聚糖结构也总是表现出异质性。在聚糖结构影响蛋白质生物活性的情况下，具有所需或不需要结构的聚糖的含量必须保持在一定范围内。即使在聚糖结构不直接影响蛋白质生物活性的情况下，也必须指定聚糖的异质性程度，并且在不同时间或不同生产地点生产的不同批次的产品都必须符合相同的规格。

结构特征和生物活性

细胞培养产物的结构通常都很复杂，如蛋白质、病毒和细胞本身。评估它们的质量并不容易。用作疫苗的病毒的质量取决于其引发免疫原性反应的能力。对于基因治疗，产物病毒的质量取决于其感染靶细胞和表达载荷基因的能力。不同的治疗性蛋白质发挥其生物学作用的机制非常不同。有些结合并中和或去除目标分子，而另一些则与目标细胞结合并引发杀伤细胞的杀伤力。在工艺过程中直接评估此类生物学功能通常是不可行的。相反，需要利用作用模式的机制知识，根据对生物功能至关重要的结构特征来开发产品质量指标。例如，对于流感病毒，除了病毒颗粒计数外，血凝素水平也可以作为质量指标。在基因治疗中，转基因拷贝与病毒颗粒的比率可用作质量衡量标准。在涉及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）活性的治疗性 IgG 生产中，岩藻糖基化聚糖被用作质量衡量标准。因此，了解所涉及产物的作用模式对于使用结构属性作为质量指标非常重要。

糖基化特性

附着在糖蛋白上的聚糖在结构上是异质的。这可以在血液循环中的糖蛋白以及细胞培养物中产生的治疗性蛋白质中看到。一些蛋白质的聚糖结构在蛋白质的治疗功效中起着至关重要的作用。例如，许多溶酶体酶的聚糖上存在的 6-磷酸甘露糖对于介导蛋白质与细胞质膜上的 6-磷酸甘露糖受体结合以进行摄取至关重要，这是将酶靶向溶酶体所必需的步骤。因此，这些酶的聚糖上 6-磷酸甘露糖的丰度水平对于治疗溶酶体贮积病至关重要。在某些情况下，聚糖结构不会直接影响蛋白质的生物学活性，但会影响其药代动力学行为，例如，促红细胞生成素和其它一些蛋白质上更高含量的唾液酸会增加这些蛋白质的循环半衰期，如果没有唾液酸，暴露的半乳糖会与肝细胞表面的脱唾液酸糖蛋白受体结合，导致内化和降解。

一个蛋白质在其序列中可能有多个糖基化位点。给定位点上的聚糖结构是不均匀的。相反，它由许多不同的结构组成。这种异质性是其在高尔基体中的生物合成反应的结果。在不同的生产过程中，或在不同的生产条件或细胞系下，聚糖的特性也可能有所不同。这种可变性对其临床疗效的影响取决于蛋白质的作用方式。对一些蛋白质来说，这是非常重要的，而对其它一些蛋白质来说，它可能会影响血液循环半衰期，但不会影响生物活性。然而，从监管的角度来看，产品的聚糖分布特性必须在规定的范围内。因此，将聚糖分布限制在可接受的范围内对于产品的质量控制至关重要。更好地理解产品的作用方式可以帮助定义产品可接受的异质性范围。

蛋白质结构异构体

在选择给定产品的生产细胞系之前，应验证整合到基因组中的产品基因的所有拷贝的DNA序列，以确保转基因的完整性。因此，预期蛋白质的一级序列和二级、三级、甚至四级结构将是一致的。然而，天然蛋白质和重组蛋白质中确实存在蛋白质的结构异构体。这是由于翻译错误、不完整的翻译后酶加工、分泌后细胞外酶促或化学反应等导致的。在更高的结构水平上，蛋白质分子可能形成二聚体或寡聚体，并且可能打乱二硫键，甚至形成大的聚集体和沉淀。在一级序列水平上，序列异构体包括蛋白质中不正确的氨基酸掺入和氨基酸的化学修饰。

许多生产细胞系具有产品基因的多个拷贝。利用高通量DNA测序技术，对候选生产细胞系基因组中多个转基因拷贝的DNA序列进行验证，以确保其完整性。一旦选择了细胞系，转基因的拷贝随后发生突变的可能性非常低。然而，在罕见的情况下，这些拷贝中的一个发生错义突变，即导致蛋白质中氨基酸改变的突变，将不可避免地导致一小部分突变蛋白质分子的存在。

一些常见的结构异构体包括氨基酸错配、电荷异构体以及更高阶结构的变化。许多蛋白质的C端有赖氨酸残基。这些赖氨酸残基在细胞内被羧肽酶裂解。然而，裂解通常是不完整的。C端未裂解赖氨酸经常出现在循环中的天然蛋白质以及重组蛋白的生产中。工业补料分批培养通常采用高葡萄糖浓度。因此，分泌的产物蛋白质分子长期暴露在高葡萄糖浓度下。糖基化是指糖与氨基酸侧链上的氨基的结合，这种现象很常见。糖基化也见于人体循环中的蛋白质中。

一些氨基酸修饰导致蛋白质净电荷的变化。这些电荷异构体可能是酸性物质，在阴离子交换层析柱中比“正常”产物蛋白质洗脱得更快，或者是碱性物质，在阳离子交换柱中洗脱得更快。带酸性电荷的异构体也可能由糖基化模式的变化引起，例如唾液酸或硫酸盐含量的增加。

工艺控制和产物质量

蛋白质中聚糖特性的异质性主要是细胞内生物合成事件的结果。当细胞活性较低时，蛋白质分泌到培养液后，细胞释放的酶会降解聚糖，尤其是唾液酸被唾液酸酶去除。蛋白质结构变化大多发生在蛋白质翻译之后，源于细胞内的事件或者是在蛋白质分泌到培养基后的培养液中。蛋白质加工酶可由细胞通过分泌或由于细胞裂解而释放。细胞外蛋白水解裂解已被证明会导致因子VIII的降解。一些更高阶的蛋白质结构变化，如聚集、蛋氨酸的氧化以及天冬酰胺的脱酰胺，甚至可能发生在产物回收过程中。

对产品质量的日益重视要求我们更好地了解细胞内事件如何影响糖基化特性，以及细胞外培养环境如何影响蛋白质异构体的发生。理想情况下，这应该提高我们控制工艺条件的能力，并提供一致的生产力和产品质量。工艺技术的发展越来越注重用于在线监测和控制的过程分析技术 (PAT)，而与PAT携手并进的是质量源于设计 (QbD)。

QbD的目的是发展对工艺过程的理解，识别对产品质量影响最大的过程变量。这将有助于制定控制这些变量的策略，并将产品质量属性限制在可接受的范围内。为了实现QbD，需要了解定义产品质量的属性，并理解过程变量和质量属性之间的关系。最初，可能依赖于过程变量和质量属性相关的经验数据。随着时间的推移，机制模型对于开发预测控制策略变得至关重要。在这样的工作中，质量和生产力是不可分离的。对生产力和质量方面的培养环境的机制理解被纳入过程模型，后者将过程输入转化为维持生产力和产品质量的必要控制行动。此外，基于基因组学、蛋白质组学和代谢组学的整体分析方法的进步，与系统方法相结合，将促进PAT和QbD在细胞培养生物工艺中的实施。

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F.Meuwly, U.Weber, T.Ziegler, et al., Conversion of a CHO cell culture process from perfusion to fed-batch technology without altering product quality. Journal of Biotechnology, 2006.

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