生物制药中的金属可提取物/可析出物及其影响

在过去的十几年里，许多生物制药公司已经转向使用基于聚合物的一次性生物工艺材料来开发生物产品，包括生物反应器袋、容器、管路、接头以及其他生产设备。特别是一次性生物反应器系统，由于其灵活性等多方面的优势，在生物制药生产中的应用稳步增加。尽管这些系统提高了生产效率，但它们的使用也存在挑战和监管问题，这其中就包括可提取物/可析出物的风险，这会影响生物制品的总体产量和纯度。

可提取物是在比塑料和系统简单接触更恶劣的条件下，从塑料中提取出来的物质。而可析出物是因塑料和系统之间相对温和的相互作用而进入产物液流中的物质。这些物质可能以工艺污染物、杂质或反应副产物的形式存在。可提取物/可析出物和产物成分之间的相互作用已被证明可能改变生物制品的物理化学性质，从而对最终产品的质量产生负面影响。因此，在生物工艺材料研究中识别和量化这些可提取物/可析出物是很重要的，以确保最佳的细胞生长和产品质量，并维持患者的安全。

重金属是最重要的可提取和可析出物之一，可导致目标生物制品的物理化学变化。有毒金属可影响细胞生长、活力和产物的产出。仔细监测和控制金属物质水平在生物工艺过程中至关重要。本文将简要介绍在生物工艺中可能存在的重金属可提取和可析出物及其影响。

钴

钴是一种可提取/可析出的金属，潜在地存在于生物工艺过程中所使用的一次性袋子中，被认为是一个高风险因素。钴在生物工艺过程中可能导致多种危险因素，特别是它对CHO细胞中半乳糖转移酶活性的影响及其对IgG表达的影响，且因其浓度变化而对细胞生长的影响有所不同，从而导致对生物制品的不同影响。如有研究测量了细胞生长必需的辅助因子锰和浓度在0– 1 mM之间的钴的影响，证实钴对半乳糖转移酶的影响是剂量依赖性的，随着钴浓度的增加，酶活性降低，这是由于酶有两个结合位点被锰和钴占据，且与锰相比，钴的结合导致了较低的活化。

同时，研究还评估了钴对重组CHO 细胞中 IgG 表达的影响，以了解其对糖基化的影响。采用不同的钴浓度，结果显示，3 天后，300 μM 的浓度会导致细胞死亡。此外，从 200 μM 浓度开始，IgG 滴度降低了 50%。在 50 μM 或更低的浓度下，未观察到对细胞生长的影响。尽管浓度在 1-100 μM 之间的钴会增加 CHO 细胞中的半乳糖基化水平，但添加锰可以稍微逆转并改善这种半乳糖基化效果。 钴还会导致 ROS 生成增加，其本身会通过降低溶氧水平刺激缺氧介导的反应。此外，50 μM 的钴导致 G1F 聚糖增加 3%，而 200 μM 的非半乳糖基化 (G0F) 增加 5%。还注意到，在 200 μM 钴存在时，乳酸产量有所增加。 

镍

镍也被认为是一种微量金属，会在生物工艺过程中对CHO 细胞产生毒性。糖基化是一种重要的翻译后修饰，会影响 CHO 细胞中的糖蛋白。它有助于提高生物制品的质量，并需要在整个生物工艺过程中进行监测和分析。镍会从生物工艺中使用的不同设备中析出，析出程度受溶液 pH 值、浓度、盐含量和温度的影响。

研究分析了镍对 CHO 细胞的影响，显示镍会抑制果糖基转移酶和半乳糖基转移酶。此外，镍影响ROS的形成，导致氧化应激并减少半乳糖基化。继而使重组 IgG 糖基化显著减少。研究还测试了镍对细胞生长和活力的影响。在高达 50 μM 的镍存在下，生长或活力没有变化。高于 200 μM 时，细胞生长显著降低，而活力保持 > 60%，直到镍浓度达到 1 mM。当镍浓度达到 200 μM 时，乳酸产量增加。当镍浓度 > 1 mM 时，还观察到 IgG 糖基化从 32% 减少到 25%。

研究还评估了镍对半乳糖基转移酶的影响。如前所述，锰是半乳糖基转移酶的重要辅助因子，因此，添加不同浓度的锰和镍以确定这是否会逆转糖基化降低。尽管添加锰增加了糖基化，但不足以完全抑制降低。

镍被评估为生物工艺过程中的主要析出物之一，需确定其对蛋白质聚集和沉淀的影响。来自不同设备的极少量镍会导致蛋白质沉淀。这种沉淀可以通过镍和蛋白质单体之间可能的螯合来解释。此外，一项研究发现，几乎所有评估的赋形剂中都发现了痕量的镍。

铜

虽然铜被认为是多种代谢途径中的基本元素，但由于产生ROS，高浓度铜可能具有毒性，导致细胞损伤。因此，生物工艺设备的铜析出可以破坏最佳平衡、诱导毒性、并阻止细胞生长。有研究分析了在不产生毒性的情况下，生长培养基中铜的最大含量。使用不同水平的铜对CHO细胞处理超过14天。获得正常细胞生长而没有任何毒性的铜的最小阈值在每压实细胞体积30-60 nM之间。用高水平的铜处理CHO细胞会通过增加IgG产物的修饰而对生物制品质量产生负面影响。研究还表明，CHO细胞需要最低水平的铜才能存活并实现最佳性能。已知C端脯氨酸酰胺化是由肽基甘氨酸羟化单加氧酶催化的，该酶需要与铜结合才能被激活。较高的铜浓度增加了该反应，导致更多的IgG产生。但铜水平超过 50 μM 会导致蛋白质聚集增加，从而进一步导致蛋白质质量下降。

有实验证明，与铜水平较低的处理组相比，对照组的细胞活力更高，推测这是由于铜含量高而在细胞内积累较慢。同时，他们还得出结论，0-100 μM 范围内的铜水平不会影响细胞生长。另有研究显示，铜会在 CHO 细胞中引起生物蓄积行为，从而中断细胞生长。这种蓄积现象可以通过铜对谷胱甘肽-氧化还原平衡的影响得到进一步解释，众所周知，谷胱甘肽是抵抗毒性的重要保护剂。这种不平衡会导致细胞生长中断。有人建议，压实细胞体积中的铜浓度应大于 30 nM 才能获得所需的益处，同时保持低于 60 nM，以避免铜毒性。

总 结

生物制药生产已经开始广泛使用一次性生物工艺系统，这种向一次性塑料系统的转变需要对可提取物和析出物进行监管和监测，以确保患者安全。尽管最终药品中可提取物和析出物的浓度较低，但它们能够影响产品质量，并存在随后增加进入患者体内的风险。对最常见的可提取物和析出物的安全阈值进行评估，可以确保生物生产过程中的细胞活力。例如，钴、镍和铜分别> 200 μM、>200 μM 和 >60 nM。钴和镍都会导致缺氧介导的反应，从而导致氧化应激。保持这些有毒金属的安全浓度对于避免对细胞生长、活力和产物生产产生任何负面影响至关重要。同样，为了确保高质量产品的生产和患者安全，有效监测这些有害可提取物和析出物的浓度至关重要。

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