高昂的产品成本和市场需求的不确定性是生物制药领域的两个主要挑战。工艺强化和连续工艺以及一次性技术对于减轻这些挑战有相当大的帮助，特别是当生产设施占地面积较小时。为了在当今竞争激烈的生物制药市场中保持赢面，必然需要开发并采用先进的技术。生物技术领域的每一个功能，无论是设备、上游的细胞培养基、还是下游的填料和膜技术，都在经历技术迭代。在工艺集成中自动化理念的应用推动了优化的且具有成本效益的流程设计，并实现更高的生产率产品质量和安全性。本文将简要介绍在生物制药生产流程中，应用工艺强化和连续工艺以及一次性使用技术的当前发展。
连续单元操作定义为工艺的一个子单元，其中存在长时间的连续液流输入以及最小的内部保持体积。输出可以是连续的，也可以分散成小批次，然后以循环方式生产。基于此定义，可以定义两种不同类型的连续工艺：(1) 混合连续工艺，其中结合了批次和连续单元操作；(2) 完全集成的单元操作或端到端工艺。目前，混合连续工艺已成为生物制药生产中的现实，其中可以区分出三种不同的类型：(1) 连续上游，然后是批次下游；(2) 连续上游和捕获，然后是批次下游；(3) 批次上游，然后是连续下游。第一种类型最为成熟，一直用于生产治疗性酶、血液因子和某些 mAb 。这种方法的开发实现了连续捕获步骤，这解决了与下游工艺相关的高成本问题，因为捕获步骤就约占成本的 25%。连续捕获方法意味着澄清步骤后不再需要大规模储罐，并且 Protein A 层析柱的尺寸理论上可以减小两个数量级，这也促使缓冲液的用量显著降低。在第三种方法中，细胞培养通常以传统的补料分批模式进行，而一、两个下游工艺操作是连续进行的，例如捕获和精纯，这可使连续层析柱变小，即成本降低。
近年来，各种一次性使用系统的普及推动了更强化且连续的 mAb 生产工艺的发展，因为现有的一次性使用技术有助于执行强化的单元操作。具体来看，又可区分上游工艺强化和下游工艺强化。上游强化通常需要使用灌流技术，即细胞被截留在生物反应器中，同时不断置换部分细胞培养基。灌流工艺已可实现高达 200×10^6 cells/mL的活细胞密度。为了以最少的培养基消耗实现如此高的 VCD，需要使用单位细胞灌流速率 (CSPR) 来控制灌流过程。CSPR 描述了基于每天、每个细胞而供应到生物反应器的培养基用量，是单个细胞营养供应的良好指标。由于在灌流过程中细胞需被截留在生物反应器中，因此生物反应器必须配备内部或外部灌流装置，以截留细胞。选择合适的细胞截留装置是灌流工艺开发中的一个重要考虑因素，其应满足以下特点：高稳定性、高细胞截留效率、无细胞损伤、高产物产量、可放大、低运行成本以及连续收获。常用的细胞保留装置包括内置旋转滤器、TFF 系统、ATF 系统、声波分离器以及离心。带有内部灌流膜过滤器的波浪式生物反应器系统因为易于使用，常用于强化种子扩增。一次性使用灌流系统的出现促进了近年来高密度种子补料分批生产和浓缩补料分批工艺的发展。除了前面提到的强化工艺之外，完全连续的灌流工艺也备受关注，在这种工艺中，营养耗竭的细胞培养基和产物被连续排出，目的是达到一种稳定状态，从而在较长时间内保持生产率和产物质量，并降低偏差。与种子扩增或N-1阶段的灌流工艺不同，连续灌流操作必须定期进行细胞废弃，即Cell bleeding，以维持必要的恒定活细胞密度以及高细胞活力。此类工艺的目标运行时间通常为30至90天，工艺在稳态条件下运行的时间越长，生物反应器的时-空产量就越高。长时间的运行对生物反应器及其内、外部外围设备在耐受性和无菌性方面提出了高要求。很多市售的一次性搅拌罐生物反应器可针对连续灌流工艺和强化补料分批操作提供专门的设计。
由于强化的上游工艺可导致固体和细胞污染物以及蛋白质聚体的浓度更高，因此收获和后续处理比传统的补料分批工艺更困难。下游工艺的强化主要有两种策略：提高层析柱的结合载量或更有效地利用载量，或者 通过连续运行每个工艺步骤来提高生产率。对于 mAb 生产中的捕获步骤，通常使用 Protein A，该技术在结合载量和稳定性方面已经经过了多次迭代。强化捕获步骤的替代方案是使用更为经济的层析技术，或者使用沉淀、目标产品结晶和两相萃取等非层析技术。此外，还可以使用膜层析法代替传统的填料柱来执行捕获和精纯步骤。膜层析法可在较低的操作压力下实现更高的流速，且可用于结合-洗脱或流传模式，但相比填料柱，其结合载量较低。强化下游工艺的另一种方法是使用混合模式层析法进行精纯步骤，与逐个执行几个层析步骤不同，其使用结合了两种或以上工作机制的填料作为层析柱的固定相。
工艺强化的最终目标是创建端到端工艺。这包括使用多柱或逆流层析的连续捕获步骤。在多柱技术中，多根层析柱并联连接并循环运行。因此，较小的柱尺寸就足够满足处理需求了。此外，这种方法消除了生产生物反应器后的保持步骤，并减少了填料和缓冲液的用量。目前市面上已有符合良好生产规范 (GMP) 的多柱层析系统，并配备完整的一次性使用流路。该类系统通常可以在结合-洗脱模式下用于捕获步骤，在流穿模式下用于精纯，包括离子交换、疏水或混合模式层析步骤，即通过结合杂质而不是目标产物，实现连续操作。在mAb下游工艺期间还必须执行病毒灭活和除病毒过滤步骤。连续病毒灭活有两种方法：使用两个交替操作的一次性混合罐，或是使用推流反应器。连续除病毒过滤采用多过滤器概念进行，其中两个单独的过滤器并联连接。一旦一个过滤器达到其处理量极限，如压力限制，系统就会自动切换到另一个过滤器，此时可以无菌更换第一个过滤器。mAb 的制剂通常需要几个 TFF 步骤，其中产物首先通过超滤浓缩，然后通过洗滤转移到适当的缓冲系统中，并通过第二个超滤步骤达到其最终浓度。单程TFF 是可用于蛋白质浓缩和洗滤的连续工艺策略，可以通过增加膜面积和降低流速来增加过滤时间，以通过单个步骤达到目的。
当前对生物制药行业的需求正在推动生产商走向过程强化，以提升单元操作或整个生产流程的效率。在上游工艺中，强化方案包括种子扩增强化、浓缩补料分批以及常见于生产生物反应器的连续稳态灌流。在下游工艺中，强化策略通常包括从单柱层析到多柱层析的转变。强化的效益在于多个方面，包括降低运营成本、加快生产进度、提高产量以及增强灵活性。而对于强化或连续工艺，一次性技术是一个相辅相成且必然的选择，其推动了现代化生物生产设施的建设，以一种更灵活、更具成本效益的方式。
作为国内领先的一次性生物工艺技术供应商，多宁生物提供从简单的管路到复杂的管组以及生物反应器在内的全面的一次性技术平台，以满足生物制药用户对更灵活、更柔性且更安全的生物制造线路构建的需求。借助多年的工程设计和合规制造经验，我们可更完美配合用户的需求，使您从设计理念到生产操作再到合规验证的路程更加顺畅。
多宁生物针对生物药生产工艺流程中的多个关键单元操作提供完全预组装、预灭菌和定制化设计的一次性管组，包括一次性层析、超滤、除病毒过滤以及制剂/灌装等，此类管组可使用内部制造或来自经客户认证的合格供应商的部件进行组装，并采用开放式架构设计，以符合不同现有硬件设备的操作要求，可充分满足工艺性能要求。包括用于层析、超滤等在内的关键单元操作的一次性管组已经过大量用户的广泛测试。
一次性管组设计示例
一次性配液系统DuoMix®/Mini DuoMix®
DuoMix®/Mini DuoMix® 配液系统由支撑容器和控制系统组成，可为生物制药工艺中的液-液、液-固混匀提供高效的搅拌效果，例如培养基配制、纯化产品收集混匀。支撑容器材质为304不锈钢，控制系统为DuoMix®标准控制系统，满足cGMP要求。配液系统有2 L – 3,000 规格可供选择，并且可根据实际需求选配pH、温度、电导、打印以及辅助蠕动泵等功能。
配液系统配合一次性搅拌袋使用，其袋体薄膜DuoFilm-001为7层复合生物专用膜，厚度0.3 mm，液体接触层为ULDPE，具有优异的理化性能和生物相容性。多宁生物确保一次性搅拌袋从原材料、产品组装、灭菌工艺完全符合cGMP和生物制药操作要求。
多宁DuoBio® Pro一次性生物反应器采用底部搅拌式罐体设计，可实现从50 L-2,000 L规模生物工艺的连续放大，结合多宁完全自主研发制造的3D一次性细胞培养袋，具有良好的生物相容性优点，其灵活的管路设计，满足各类复杂的上游工艺过程；其独特的搅拌通气一体组合设计，不仅能降低剪切同时又保证了优异的传质和混匀性能，放大前后工艺一致性好，可广泛应用于生物制药工艺研发到GMP生产等各个阶段。
*详细产品信息，请联系marketing@duoningbio.com
D.Müller, L.Klein, J.Lemke, et al., Process intensification in the biopharma industry: Improving efficiency of protein manufacturing processes from development to production scale using synergistic approaches. Chemical Engineering and Processing – Process Intensification, 2022.
K.V.K.Boodhoo, M.C.Flickinge, J.M.Woodley, et al., Bioprocess intensification: A route to efficient and sustainable biocatalytic transformations for the future. Chemical Engineering and Processing – Process Intensification, 2022.
O.A.Prado-Rubio, R.Morales-Rodríguez, P.Andrade-Santacoloma, et al., Process Intensification in Biotechnology Applications, 2016.
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