工业规模包涵体复性工艺的开发

大肠杆菌是使用时间最长、应用最广泛的重组药物蛋白表达宿主之一。迄今为止，超过25% 的重组生物药物是在大肠杆菌中生产的。其众所周知的遗传特性、对其生理学的深入了解和大量表达载体工具箱的可用性，以及其低培养成本、短培养时间和产生大量重组蛋白的能力，使其成为一种有吸引力的宿主生物，可用于基础研究和工业生产。

大肠杆菌中重组蛋白过度表达后，通常会出现包涵体(IB) 。虽然以包涵体形式而非可溶性蛋白质形式生产重组生物制药具有诸多优点，例如产物产量高（每升培养液可产出超过 20 g的包涵体）、产物纯度高（总蛋白质含量高达 95％）、包涵体具有较高的机械稳定性和热稳定性、降低对蛋白水解的敏感性、以及与宿主细胞蛋白相比，大小和密度存在差异，因此易于分离包涵体。但对于包涵体，需要进行复性（重折叠）才能生成天然蛋白，然后进一步纯化，以获得纯化且有活性的生物制品。尽管多年来，在细菌包涵体的温和变/复性方法开发方面取得了很大的进展，但在工业规模条件下实施此类策略仍需要针对多方面因素的进行深入的考虑。本文旨在简要介绍工业规模包涵体复性工艺的开发路径。

新产品工艺开发的开始类似于黑匣子，通常只知道蛋白质的序列，并且研究数据表明目的产物具有治疗作用。为生产用于临床前研究的材料而开发的纯化工艺通常在小体积中进行。因此，早期工艺生产的产品量太少，无法满足市场需求。因此，有必要进一步工艺优化和放大。时间和成本是工业化工艺开发的关键因素。通常使用平台工艺、规模缩小模型和基于计算机的建模方法来确保快速的开发时间线。工艺开发的总体目标是设计稳健且可靠的生产工艺。

初步筛选和优化复性缓冲液

为了实现包涵体溶解和复性，通常需要对缓冲液条件进行初步筛选。实际上，这些条件必须根据每个目的产物的经验来确定，这个过程可能非常耗时且费力。因此，该领域的研究已转向使用高通量开发方法来简化该过程。

通常在工艺开发过程中，采用实验设计（DOE）方法，以自动化方式筛选缓冲液条件，总体积较小（<2 mL），目的是在合理的工艺持续时间内（<12 小时）获得高产量和高复性浓度。此外，它还旨在限制缓冲液中的成分数量，以实现较小的经济和生态影响。如果产量较低，例如，产量低于 50% 或折叠条件下目的产物的最终浓度低于 0.5 g/L，则通常会修改缓冲液条件。因此，复性缓冲液的组成很难预测，必须针对每种目的产物重新建立，以促进其天然构象。使用 DOE 方法可以提高难复性蛋白质的产量，例如使用固有荧光、 zeta 电位和 RP-HPLC等分析工具确定模式抗体片段的重折叠动力学，根据初始 DOE 的结果，进行优化 DOE，对局部化学微环境，如稀释因子、氧化还原对和pH 值，的细微调整导致测试抗体片段的重折叠效率大幅提高。

工艺设计

筛选出最佳溶解/复性缓冲液后，在台式设备中进一步测试缓冲液组合并进行优化。通常，工艺开发是按顺序进行的。一个工艺步骤（如溶解）的最佳条件作为下一步（如复性）的输入，后者又为下一步（如捕获层析）提供输入。然而，这种方法没有考虑到远距离工艺步骤之间的相互依赖性。可以利用集成过程模型和机器学习技术来规避这个问题，即使用过程建模和高通量方法来整合溶解、复性和捕获层析，与标准方法相比，可获得更高的收率。此外，可以使用 DOE 方式在并行的台式反应器中筛选对更大规模操作至关重要的工艺参数，并进行统计评估。从这些实验数据中，可以确定稳健的复性条件和动力学。

一般来说，蛋白质复性性能通常受到许多因素的影响。这些因素包括 pH 值、温度、缓冲液组成、氧化还原系统或二价离子和添加剂的存在。但反应物的性质或目的产物的固有特征也会影响复性性能。已知蛋白质序列会影响复性性能，但由于时间和资源有限，这种影响如何发生通常无法在工艺开发的背景下完全解答，蛋白质中配对半胱氨酸的存在可以作为可能的工艺开发路线的指标。此外，蛋白质的疏水性模式和机器学习方法的结合也有助于提供支持性信息。

此外，可以考虑影响可制造性的进一步影响，例如搅拌器速度、工艺持续时间、容器尺寸和几何形状，甚至选择的复性方法，如批次、补料分批或反向稀释。在实施基于风险的方法之前，应评估可能影响复性过程的因素。

显示了机械和化学工艺参数对蛋白质复性过程影响的鱼骨图

在工业环境中，复性应在高蛋白质浓度下进行。然而，蛋白质浓度的增加会促进聚集并降低总产量。已知复性过程会与聚集过程竞争，因此降低变性蛋白质的注入速率并确保蛋白质/复性缓冲液界面的湍流状态应能减少聚集体的形成。溶解蛋白质与复性缓冲液可以通过多种方法混合。包括批次、补料分批和反向稀释。在批次复性中，溶解的蛋白质一次性加入到复性缓冲液中。这种方法通常用于工艺开发过程中的第一次实验，但在后期开发中需要改进，以减少剪切力，并允许使用生产规模的泵送设备进行处理。在补料分批方法中，溶解的蛋白质以脉冲方式或在较长时间内连续添加，这可提高工艺生产率（g/L/h）。反向稀释也用于工业规模，其中，复性缓冲液被稀释到罐内已经存在的溶解蛋白质中，这里，相对缓慢的条件变化有可能降低聚集的趋势。

强离液条件会影响复性和聚集的速率，但聚集受到的影响更严重。因此，变性条件必须足够低以促进蛋白质的柔韧性并允许目的产物复性，但也必须足够高以防止蛋白质聚集。同时，还需要优化的氧化还原对以确保目的产物正确复性。必须考虑和测试从缓冲液制备到使用氧化还原对期间的稳定性。此外，容器顶部空间的氧气存在会影响复性性能。

在复性领域，已有几种方法被熟知并应用于工艺放大。这些方法旨在保持诸如雷诺数(Re)、混合时间、功率输入和 kLa (氧气从气相转移到液相的速率) 在不同规模条件下保持恒定。这些参数与设备相关，需要通过初步测试（混合时间，kLa）或计算流体动力学（CFD）获得工艺知识。不同规模条件下，容器几何形状（高度/直径比）和搅拌方法的变化使得决定应用哪种放大系数变得困难。

目的产物结构中二硫键的存在与否为如何进行放大提供了很好的初步线索。如果目的产物不含半胱氨酸，则不会形成二硫键来支持复性，而氧浓度或与氧化还原对的平衡将仅具有次要的重要性。然后可以考虑通过恒定功率输入或混合时间进行放大。然而，生物治疗药物中不含有半胱氨酸的可能性很小。如果目的产物含有配对的半胱氨酸，则应进行实验以量化复性过程中的氧依赖性。由于氧依赖性也依赖于所用的氧化还原系统，因此应在实验室规模的实验中进行。一种简单的方法是通过在复性过程中用氧气或氮气叠加来置换或富集所用缓冲液中的氧气。当动力学或总步骤产量不再增加时，可获得目的产物的最佳氧化还原对。如果缓冲液通气可提高整体工艺性能，则可以修改所选的缓冲系统以获得具有成本效益的工艺。

工艺温度也会影响最终产量、反应动力学和复性池的稳定性。这些影响在很大程度上取决于目的产物和所用的技术。抗体片段的复性在15-30°C 的范围内是稳定的，尽管域间二硫键的形成主要取决于环境温度。工艺温度和温度控制方法已经显示出了减少聚集的良好效果，所以温度可以作为工艺开发中的一个校正变量。

工艺规模放大及实施

在生产工厂中实施已开发的复性工艺之前，通常会在更大、更具代表性的规模下进行测试，其特征性放大倍数为10 到 20。然后在转移到生产工厂之前确定最终设置。大部分工作应该在早期开发阶段进行，此时实验成本较低，并且可以实现大多数改进工艺设计的效果。在工艺开发过程中，需要经验和结构化的方法来考虑正确的因素。为了开发强大的工艺，应遵循质量源于设计 (QbD) 方法，这是一种整体的、科学驱动的战略。

新工艺的可行性在很大程度上取决于生产设施的能力。当然，在工艺开发过程中，新工艺会适应现有工厂设备的限制，但在某些情况下，必须通过额外的工厂设施来克服限制，如调整进水管线、泵、可移动的中间罐等，从而实现稳健的工艺布局。在实际测试或生产运行之前，可以在建模和模拟的支持下规划复杂的子步骤。计算流体动力学(CFD) 研究提供了良好的设备表征。它提供了对设备中发生的混合和反应现象的洞察，如对反应动力学的局部影响、粘度和密度变化、相分离和流动曲线等。瞬态或静态过程建模和模拟有助于早期映射和协调工艺流程布局，以确定宏观限制，如反应速率、缓冲液体积、膜面积、流速等。

监测工具

尽管有各种结构化方法，但复性仍然是一个黑匣子，开发基于经验主义，并且严重依赖离线数据，尤其是在工业环境中。在线测量、监控、建模和控制此工艺步骤对于避免工艺性能和产品质量出现不必要的偏差非常重要。过程分析技术(PAT)是通过测量关键工艺参数 (CPP) 来分析和控制生产过程的工具。关键过程参数（CPP） 是在工艺开发过程中已证实会影响最终产品质量的工艺参数。应以瞬态方式监控预定义的 CPP，从而提高数据一致性并最大限度地减少批次失败。

PAT的实施通常使用两种方法：软传感器，即基于在线可测量数据，如氧化还原、溶氧、pH；以及光谱方法，通常在线、近线或旁路应用。过去几十年来，光谱工具因其快速的测量时间和可能的在线/入线实施策略而成为有前途的过程监控工具。此外，这些基于光谱的仪器被证明能够识别蛋白质二级和三级结构的变化，这是确保生产过程中蛋白质稳定性所必需的知识，如使用差示扫描荧光法，可快速区分未折叠、错误折叠和折叠状态，或者实施各种分析工具来揭示蛋白质结构、稳定性和功能之间相互作用的潜力。然而，这些技术尚未实现针对不同蛋白质形式和高复杂性缓冲液的普遍应用，未来的主要关注点应放在 PAT 技术的更广泛适用性上，并考虑最常用的缓冲条件。

鉴于潜在重组产品的结构差异性很大，预计对复性策略优化的需求将持续甚至增长。同时，自动化和高通量方法的不断改进将有助于克服经验障碍。结合强大的分子建模和数据管理工具，这将从本质上节省资源，缩短工艺开发时间，并总体上促进更稳健、更高效的生产工艺。

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L.Buscajoni, M. C. Martinetz, M. Berkemeyer, et al., Refolding in the modern biopharmaceutical industry. Biotechnology Advances, 2022.

L.Strandberg, S.O. Enfors, Factors influencing inclusion body formation in the production of a fused protein in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology, 1991.

M.Mayer, J.Buchner, Refolding of Inclusion Body Proteins. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases, 2004.

S.M.Singh, A.K.Panda, Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2005.