GMP级干细胞培养的挑战和发展趋势

由于通常从天然来源获得的干细胞数量较少，GMP级干细胞培养面临的主要挑战之一是选择最佳扩增系统。该系统必须使用无异种培养基、生长因子和添加物扩增未分化状态的干细胞。3D生物反应器是克服静态培养限制的可行选择，因为它们提供了一个可放大的系统，其中可以监控和控制操作因素。

关于培养系统的首要选择要素是生物反应器的类型，必须考虑扩增细胞的最终应用。例如，搅拌罐生物反应器是相对简单的培养系统，由一个带有搅拌桨的容器组成，搅拌桨搅拌内部物质以提供均匀的培养液。此类培养系统已成功测试了在无异种条件下扩增不同类型的干细胞，包括间充质干细胞 (MSC)、诱导性多能干细胞 (iPSC) 和胚胎干细胞（ESC）。使用这些系统时需要关注产生的剪切应力，可能会损坏对剪切敏感的细胞，通过控制搅拌桨的形状和搅拌速度，可以最大限度地减少这一问题。

该类生物反应器系统中必须监测和控制的另一个重要参数是氧饱和度。在不同 O2浓度下培养的干细胞可能在细胞增殖、活力和分化能力方面表现出显著差异。一些研究测试了在低氧饱和度（约 5%）下培养iPSC和 ESC，在缺氧条件下观察到细胞从有氧到无氧途径的显著代谢变化。但这种情况导致乳酸浓度升高，培养基的 pH 值从中性变为酸性。当在 ESC培养中使用 30% 的氧饱和度时，实现了更高的代谢和细胞生长率。

生物反应器的设计对于临床级干细胞的扩增至关重要，并且必须完全符合GMP法规，而生物反应器容器特性（例如材料、尺寸和形状）是影响细胞生产并最终影响生物工艺成本的关键参数。生物反应器的材料和设计应便于清洁和生产步骤，从而防止任何污染的可能性。在这方面，一些生物反应器系统已经开发出使用一次性装置作为避免清洁过程和降低污染风险的新策略。

上述系统可以与微载体结合，从而将系统的特性与其融合在一起，所以，未来的趋势可能集中在探索这些具有不同微载体特性的生物反应器系统，以针对特定的干细胞类型，最大限度地提高细胞产量，同时保持其活力和多能性。

培养基和添加物

维持和扩增干细胞所需的培养基、生长因子、细胞因子和其它添加物是上游生物工艺中的关键元素。培养基配方中包含异种或未定义的化合物以及对细胞功能所涉及的多种分子和细胞机制的不理解是需要解决的主要问题。培养基和添加物中的异种成分具有潜在危险，因为它们可能含有可传播给培养细胞的致病因子，从而阻碍其用于医疗应用。例如，胎牛血清 (FBS) 是一种低分子量和高分子量生物分子的异种复合混合物，传统上被包含在培养基配方中以促进细胞生长。然而，众所周知，它们的生产批次间含量存在显著差异，从而改变了生物分子的批次间浓度和工艺的可重复性。这在GMP级干细胞培养中必须完全避免，因为它可能含有不良因素，如：内毒素、支原体、病毒污染物和朊病毒蛋白。

细胞与微载体分离是直接影响细胞活力的重要步骤。目前，已经开发了不同的分离策略，这些策略与基于微载体的生物工艺完全兼容。其中，基于蛋白水解酶的方法最为常用。传统上，胰腺衍生的牛和猪胰蛋白酶是广泛用于细胞分离的酶。尽管这些酶很有效，但它们的动物来源使其无法用于医疗环境，必须探索无异种替代品。重组胰蛋白酶样酶，如 TrypLE 和 TrypZean是解决胰蛋白酶使用不便的办法。虽然这些酶在不同的生物体中表达，但它们在不同的比较研究中表现出与胰蛋白酶相似的干细胞分离活性。