更强化的生物工艺新范式，解决新一代抗体产品的生产挑战

单克隆抗体 (mAb) 自几十年前问世以来，已经重塑了生物制药和靶向治疗市场，其开发策略的不断改进产生了一个充满希望的未来。简单来说，单克隆抗体是具有高特异性的免疫球蛋白，具有高特异性，选择性地靶向单个抗原表位，从而允许对特定疾病进行靶向治疗，大大减少副作用并提高疗效。治疗性单克隆抗体的工业生产经历了显著的增长扩张，且随着越来越多的产品实现商业化，很多此前认为的问题和挑战已经得到解决，所以当前的主要目标已经转变为如何进一步强化和优化生产工艺，以降低成本，提高经济效益。

生物工艺优化由于其复杂性以及潜在的高成本性质，可能是一项艰巨的任务，由于这些原因，许多生物制药公司会避免在这方面花费太多时间或金钱。尽管理论上有更好的替代方案和优化机会，但低效的批次工艺仍然主导着市场。考虑到在生产过程的每个阶段必须考虑的众多工艺参数，这在某种程度上是可以理解的。

生产治疗性单克隆抗体的哺乳动物细胞在悬浮培养中生长，需在保持90%以上活力的同时，实现非常高的细胞密度。为了实现这一目标，必须构建一种稳健且高产的单克隆抗体细胞系。为此，首先使用一个具有现有选择系统的工业哺乳动物细胞系以专为特异性单抗设计的表达质粒转染。然后将转染的细胞在选择培养基中培养，并在数周内扩增。在此过程中，鉴定并选择产量最高的无性系进行进一步扩增。一旦理想的克隆经过数周的反复选择和扩增，小体积的细胞被放置在低温保存管中，形成一个主细胞库。单个管从这个主细胞库中取出，用于创建工作细胞库。低温保存的细胞通常首先接种在小体积摇瓶中进行批次培养。一旦在摇瓶中达到较高的细胞密度，细胞传代到一个小的种子生物反应器中并再次培养到高密度。这一过程在越来越大的种子生物反应器中迭代重复，直到最终进入最后的生产生物反应器，其体积通常为数百甚至数千升。当最终培养物低于期望的活力阈值后，通过离心和过滤去除细胞和固体碎片，并保存回收的料液用于下游处理，即mAb纯化。

该行业已经实施了许多改进措施，以提高细胞密度和活力，以及单克隆抗体滴度和质量。例如，过渡到无血清培养基，以通过消除培养基组成的可变性，从而提高培养的可重复性，以及开发细胞过程的预测数学建模，以节省优化培养条件所需的大量时间和资源。本文将简要介绍在上游工艺中，可能实现强化的一些路径。

一次性生物反应器以及提高工艺监测和控制

生物反应器的使用为产单抗哺乳动物细胞培养提供了诸多优势，但是各种生物反应器的尺寸、结构和功能非常不同。在最近的发展中，许多生物反应器制造公司正在将重点转向一次性生物反应器，而不是可重复使用的不锈钢生物反应器。在大规模工业环境中，一次性生物反应器很有吸引力，因为它们大大降低了污染的风险。对于不锈钢生物反应器，必须在两次培养之间进行大量的清洁和消毒工作，以避免污染。一次性生物反应器到货时已预灭菌，并可在使用后进行抛弃处理，减少了清洁和消毒所需的时间和资源，并消除了下一次培养中污染的风险。在生物反应器的管路和端口中使用一次性无菌连接器也是在接种、取样和培养补液期间保持无菌性的必要内容。当然，另一方面，限于一次性生物反应器的体积限制，对于超大型生产规模，不锈钢生物反应器仍是唯一的选择。

外围技术用于实时在线监测和控制重要的过程参数，如pH值、气体级联强度、溶解的O2、温度和搅拌速度，随着用户友好和行业标准软件的开发，保持稳健且自动化的过程控制变得越来越容易。生物反应器设计以及过程控制和监测技术的不断改进将允许单克隆抗体产品的强化及可重复性生产。

多宁DuoBioX® Pro一次性生物反应器采用底部搅拌式罐体设计，可实现从50 L-2,000 L规模生物工艺的连续放大，结合多宁完全自主研发制造的3D一次性细胞培养袋，具有良好的生物相容性优点，其灵活的管路设计，满足各类复杂的上游工艺过程；其独特的搅拌通气一体组合设计，不仅能降低剪切，同时又保证了优异的传质和混匀性能，放大前后工艺一致性好，可广泛应用于生物制药工艺研发到GMP生产等各个阶段。

培养模式：补液分批、灌流 vs. 批次培养

在工业环境中，批次培养由于其简单性和悠久的成功历史，无疑是最广泛用于单克隆抗体生产的方法。然而，补液分批培养原则上可通过提供关键营养物质以防止耗竭来改进培养，但这增加了培养体积。连续培养采用类似的策略，但去除等量的添加体积，以避免增加工作体积和稀释培养，然而，这导致在补液时总活细胞数减少。灌流培养技术在此基础上进行了改进，过滤掉营养耗竭的培养基和部分细胞碎片，同时截留所有细胞。

这些技术的实施在理论上是非常明智的，但实际纳入工业生产过程需要大量的开发以及优化时间和成本。然而，补液分批和灌流技术的长期可持续性和前景已经促使一些能够承担高额前期成本和技术转移的大型生物技术公司将其更多的工艺从传统方法中转移出来。

组学表征

细胞系的全面表征是优化培养的关键因素。通过优化工艺参数，更好地适应它们的生长和生产力需求，对其组成和行为特征进行更深入的了解是必要的第一步。代谢组学广泛地描述了细胞中作为底物、中间体或代谢过程产物的小分子的大规模定量，这些小分子共同构成了代谢组学。液相色谱-质谱 (LC-MS) 是代谢组学中应用最广泛的方法，其它技术包括核磁共振 (NMR) 和气相色谱-质谱 (GC-MS) 等。

蛋白质组学类似地描述了由细胞培养产生的蛋白质的大规模鉴定和定量。由于蛋白质的表达有多种目的，蛋白质组学可以用来表征功能和结构蛋白质组。凝胶电泳和SDS-PAGE是常用的蛋白质表达谱分析方法，质谱法与色谱法串联使用用于蛋白质的分离和结构表征。

基因组学和转录组学需要通过PCR、DNA微阵列、下一代测序和RNA测序等手段绘制和表征细胞的DNA和转录RNA，这有助于进一步了解特定细胞系在关键生长和代谢阶段的基因组和功能转录组。脂质组学描述了通过质谱或核磁共振对特定脂质的色谱分离和随后的鉴定和定量。像蛋白质一样，脂质不仅对结构组成(即磷脂膜)有重要贡献，而且对细胞代谢也有重要贡献。所有这些“组学”技术，可用于在成功和失败培养的不同阶段开发细胞特征的综合信息。

培养基设计和补液策略优化

培养基的作用是为培养细胞提供关键营养物质和大分子的唯一外源支持，因此其组成对mAb生产的优化和成功至关重要。维生素、氨基酸、缓冲盐、脂质和微量金属的相对浓度会对培养细胞的生产力和活力产生重大影响，许多细胞系对任何成分的偏差都非常敏感。研究发现，用不含血清的化学限定培养基替代含血清的培养基，通过消除血清批次间成分差异的重要来源，极大地提高了培养的可重复性，这对于维持稳健的生物工艺尤为重要。然而，考虑到没有两个细胞系具有相同的营养需求，优化单克隆抗体生产的一个重要步骤是确定培养基组成，以满足任何给定工业相关细胞系的特定生长和生产力要求。

这种优化可以通过对培养基成分和细胞代谢物的动态消耗和生产的实验观察以及前文描述的“组学”数据相结合来实现。对不同条件下培养代谢行为的显著变化的识别，可以阐明关键营养物质的过剩或缺乏，这两种情况都可能导致生长抑制、生产力低下以及有毒代谢物 (如乳酸和氨) 的累积。研究表明，仅通过优化培养基就能精确满足细胞维持和增殖、单克隆抗体产生和能量代谢的营养需求，从而显著提高单克隆抗体生产细胞系的单位体积生产力。

多宁细胞培养基产品研发团队根据mAb的生产工艺特点，重点研究培养基配方机理、CHO细胞代谢机制及培养基稳定性，并通过CHO细胞代谢模型分析合理的实验设计，成功设计开发了Media C系列和DN feed系列培养基产品。该套产品可满足不同类型CHO细胞（CHOK1、CHOS、DG44等）的生长、代谢和表达需求。Media C系列和DN feed系列结合了高性能和高品质的两大优点，其卓越性已在多个临床后期和商业化项目证实。

多宁MediaC系列无血清培养基即DN feed系列补液培养基

实验设计方法

细胞内的生化过程已经被广泛绘制，以更好地了解它们的需求和行为，研究人员也能够应用数学方程来描述它们的动态关系。这是生物工艺开发和优化中最重要和发展最快的领域之一。简而言之，DOE是一种优化策略，它使用应用统计学来生成一系列不同的实验条件，从而以高度可控的方式对多个工艺参数进行综合测试。系统地评估每个参数及其对工艺反应的影响，如单克隆抗体产量或细胞密度，以最大限度地提高生产力，并使可变性最小化。一种称为析因设计的技术用于确定在实验运行期间要改变哪些因素以及将测试多少个水平，例如低、中、高。每个实验或运行，涉及到一个独特的组合因素水平的应用，称为处理。例如在一项3^3因子设计中，三个因素分别在三个不同的水平上进行测试，虽然该设计有27种可能的治疗方法，但研究只进行了10次试验，这是一个分数因子设计的例子，其中从全因子设计中选择处理的子集，以强调最可能具有最大影响的变量的重要性，同时最小化时间和成本。筛选实验可以用来确定重要因素，以重点进行分数因子设计。

多宁生物DuoBioX® Explore是一款设计领先、性能优异、功能齐全并且易于操作的细胞培养反应器系统，适用于生物制药行业细胞培养工艺的开发研究。用户只需要一台电脑就能同时控制1至8台玻璃罐相互独立或平行组合运行，这将极大加速工艺开发进程。DuoBioX® Explore多联平行反应器内嵌DoE功能，提供多种DoE方法选择，功能涵盖筛选和优化，试验设计一键分配至卫星罐，可实现无缝对接，结果分析可视化图形输出，确定最优范围，是上游工艺条件优化和表征研究的最佳搭档。

DuoBioX® Explore 多联平行生物反应器系统

*详细产品信息，请联系marketing@duoningbio.com

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