肺炎球菌多糖结合疫苗中的常用结合机制

2024. 10. 25

肺炎链球菌是一种有荚膜的革兰氏阳性菌，其是一种重要的人类病原体，可引起肺炎、中耳炎、脑膜炎和菌血症，每年全球约有100 万人因此死亡。其主要毒力因子之一是荚膜多糖 (CPS)，该多糖参与介导细菌与环境之间的直接相互作用，保护病原体免受宿主免疫反应机制的影响。根据其荚膜多糖，肺炎链球菌被分为 90 多种不同的特定类型。

由于每种血清型之间的交叉反应有限，许多不同血清型的传播对有效疫苗的开发构成了挑战，最佳疫苗应包括最普遍和最具毒力的血清型。多糖肺炎球菌疫苗可以在没有 T 辅助细胞的情况下刺激 B 细胞产生抗体。这种类型的反应被称为胸腺非依赖性反应或简称为 T 非依赖性反应。大多数多糖不能与主要组织相容性复合体 (MHC) 一起加工和呈递，因此不能被辅助 T 细胞识别。一般来说，多糖抗原由重复单元组成，可诱导 B 细胞受体 (BCR) 交联，从而激活 B 细胞。由于缺乏 T 辅助细胞的协作，抗体通常亲和力较低，主要由 IgM 组成，同种型转换为 IgG 和 IgA 的次数有限，记忆性 B 细胞的产生也减少。因此，T 非依赖性抗原是较差的免疫原，尤其是在幼儿中。

由于需要针对这些荚膜多糖的更有效疫苗，因此人们将其与免疫原性载体蛋白结合，从而产生能够诱发更好的T 细胞依赖性记忆反应的结合物。这些疫苗可被抗原呈递细胞 (APC) 处理，蛋白质成分中的肽可与 MHC 结合呈递，并被辅助 T 细胞识别。T 辅助细胞的激活可诱导更好的反应，包括抗体亲和力成熟、同种型转换以及诱导 B 记忆细胞产生更好的二次反应。

1980 年，Schneerson 及其同事利用多核糖基核糖醇磷酸多糖 (PRP) 与 CRM-197（一种无毒的白喉毒素重组变体）结合，研制出了一种 b 型流感嗜血杆菌 (Hib) 结合疫苗。几年后，由于这种疫苗的成功，惠氏制药将7种最常见的肺炎链球菌的 CPS 与 CRM197 结合，生成了第一种针对肺炎球菌的结合疫苗（Prevnar7®）。除了 CPS 和载体蛋白之外，许多其它因素也会通过结合方法而影响疫苗的有效性，其中包括特定结合物的化学特性、是否存在多糖-蛋白交联或间隔臂、以及结合多糖半抗原的大小等。

纯化的多糖可以以天然形式使用，也可以通过机械或化学方法降低尺寸。多糖尺寸降低会降低溶液的粘度，从而促进与蛋白质载体的化学结合。此外，作为 CPS 纯化的替代方案，可以使用化学合成或大肠杆菌糖工程。

本文将简要介绍再肺炎球菌多糖结合疫苗中使用的主要结合技术。尽管多糖中OH 基团含量高，但它们的反应性不足以直接与蛋白质结合。因此，它们需要活化才能与蛋白质共价结合。多糖的最佳活化取决于其结构。可以通过化学或酶促反应将新的功能基团引入这些多糖的结构中，从而赋予它们新的物理化学和生物学特性，以用于进一步与蛋白质共价结合。已经利用各种用于活化多糖的结合化学方法将多糖抗原与蛋白质载体结合。其中包括传统的、广泛使用的还原胺化和用溴化氰或相关基团（如 1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐 (CDAP)）活化，主要促进形成高分子量、异质且相对不明确的网络状结构。

还原胺块

很多已获批的肺炎球菌多糖结合疫苗使用该方法，其通过糖源性的醛和蛋白质中的胺之间形成席夫碱实现糖-蛋白质结合，然后进行还原。第一步是通过用高碘酸钠进行部分氧化，沿多糖链引入醛基。糖环上的顺式二醇和唾液酸残基是通过高碘酸盐氧化生成醛的最敏感区域。然后将载体蛋白添加到反应中。糖中的醛通常与载体蛋白的赖氨酸残基发生反应。该方法首先通过席夫碱在糖中的羰基和蛋白质中的氨基之间形成键，然后用弱还原剂氰基硼氢化钠将席夫碱还原为更稳定的胺。

此外，使用接头插入化学手柄进行结合，以减少空间问题，可以改善结合过程。另一种改善策略是使用铵盐来提供可用于结合的反应性胺或使用二酰肼间隔物。插入的胺可以直接与蛋白质酸残基的羧基反应，或与各种双功能接头结合。

还原胺化由于其简单性而被广泛应用于糖结合物的合成，但它的缺点包括产率低、结合效率低以及多糖结构部分降解的风险。结合方法会影响所诱导抗体的免疫原性和功能性，导致与野生型血清型的交叉反应不足。有研究表明，使用还原胺化结合19F 多糖会诱导出一种新的表位，这种表位在 19F 多糖的天然形式或使用氰基化作为结合方法时不存在。此外，还原胺化之前的高碘酸盐氧化步骤可能会打开糖环结构，这可能导致开环结合物，具体取决于血清型。

还原胺化通常在碱性条件下实现，原因是早期研究的脑膜炎球菌B和C荚膜多糖中的聚唾液酸对酸不稳定。为了避免可能的降解，建议在氰基硼氢化钠存在下，在 pH 9.0 的磷酸盐缓冲液中进行末端氧化的聚唾液酸与破伤风类毒素的结合。然而，有研究在通过还原胺化结合几种肺炎球菌荚膜多糖的过程中观察到了碱性条件下多糖的显著降解，而在微酸性介质中进行氧化多糖与牛血清白蛋白（BSA）的结合可以改善还原胺化并防止降解。

1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐（CDAP）氰基化

该方法源自经典的糖与蛋白质结合策略，即用溴化氰(CNBr) 活化多糖。虽然CNBr是一种低成本试剂，但它毒性很大，使用时需要特别注意。已知多糖脂肪族羟基的亲核性不足以直接与 CNBr 反应，并且不可能在中性 pH 下进行反应。该传统方法的特点是在强碱性反应介质中使用 CNBr。活化产率仅为 0.5-2%，这意味着使用大量 CNBr，且所需的高pH值条件可能会损害敏感的多糖。该方法的另一个缺点是活化多糖包含不同比例的氰酸酯和亚氨基碳酸酯结构。氰酸酯基团在高 pH 下水解，而亚氨基碳酸酯在更酸性的 pH 下水解时形成无活性碳酸酯。

尽管存在这些缺点，该方法仍然是多糖型基质活化的最常用方法之一。作为一种替代策略，可以使用合适的“氰基转移”剂来提高 CNBr 的亲电性，这不需要反应介质中存在强无机碱，从而可以避免依赖碱的副反应。这些复合物比 CNBr 更亲电，因此能够将多糖中质子化形式的羟基氰基化，从而在更低的 pH 下生成氰酸酯。经典的氰基转移方法之一是基于 CNBr 和低廉且易于获得的叔胺 TEA (CTEA) 之间形成高反应性盐型复合物。反应产率大大提高，但 CTEA 不稳定，在高于 −10 °C 的温度下会衰减。同样，研究发现1-氰基-4-(二甲氨基)吡啶四氟硼酸盐（CDAPBF 4或CDAP）是多糖的高效活化剂。

CDAP 已被引入蛋白质-多糖结合疫苗，用作氰基化剂，用于激活可溶性多糖。与 CNBr 相比，CDAP 更易于使用，其优势在于它可以在比 CNBr 更低的 pH 下激活多糖，且副反应更少。与 CNBr 不同，CDAP 激活的多糖可以直接与蛋白质结合，从而简化了工艺流程。此外，CDAP 活化的多糖可以用二胺或二酰肼进行功能化，以制备氨基或酰肼衍生的多糖。可以通过 pH 控制和缓冲液优化、以及平衡CDAP的稳定性、与多糖羟基的反应以及活化多糖的稳定性等因素来进一步优化 CDAP 多糖活化，如提高 pH 值并在低温下进行反应，可以减少 CDAP 水解，增加可用于反应的活性试剂，且该条件对活化速率的影响极小。

总结

近几十年来，肺炎球菌多糖结合疫苗已成为预防肺炎球菌感染的重要工具。该类疫苗使用多种结合方法，常见的为还原胺化和CDAP 结合。尽管这些疫苗取得了重大成功，但这些方法也存在重大缺点，包括产量低和成分降解。因此，最近出现了不同的新设计，如使用半乳糖氧化酶法进行还原胺化、多抗原呈递系统平台、蛋白聚糖结合技术等，以解决传统方法中可能出现的降解和低定义结合的特点，它们很可能成为新一代肺炎球菌多糖结合疫苗的一部分。

多价结合疫苗的典型生产流程，其中多糖单独发酵生产，偶联至载体蛋白并纯化，然后组成形成最终的制剂。

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